复苏金黄色葡萄球菌SAATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌ATCC8099,并分别接种于营养琼脂培养基中,持续培养18~24h。于菌株培养后,使用无菌接种环挑取培养物,置于0.85%无菌生理盐水中,制成细菌换悬液,并以麦氏比浊法适当调节细菌含量(5×105~5×106cfu)。
使用臭氧水生成器制备臭氧水后,取容量为1L的大烧杯,于充分清洗、消毒后,以臭氧水冲洗3次,每次3min,然后用于连续接取4份臭氧水,分别置于4℃、10℃、23℃、30℃恒温实验箱中,观察不同时间臭氧水浓度(mg/L)变化情况,分析臭氧水在不同温度条件中的稳定性。
碘量法检测原理:臭氧能够和碘化钾水溶液发生反应,并游离出碘。于臭氧水配置后获取样本,使用0.01mol/L硫代硫酸钠溶液(硫代硫酸钠标准溶液)滴定游离碘,计算硫代硫酸钠消耗量即可得出臭氧量。具体反应公式如下:
O3+2KI→O2+I2+2KOH
I2+2Na2S2O3→2Nal+Na2S4O3
碘量法具体检测步骤:获取100mL臭氧水,将其转移到500mL容量瓶当中,并加入20mL碘化钾溶液、10mL硫酸溶液,以缓慢晃动方式使液体完全混匀,然后加入硫代硫酸钠标准溶液,持续滴定至颜色消失,一边滴定一边轻柔晃动。于滴定结束后,统计硫代硫酸钠标准溶液使用量。臭氧量(C)计算公式如下:
C=2.4×L(其中L为硫代硫酸钠标准溶液使用量,单位mL)
使用臭氧水生成器制备2mg/L的臭氧水溶液,以金黄色葡萄球菌为例,进行中和剂实验,以选择理想中和剂。以《医院消毒技术规范》中的相关规定为依据,将实验设置为6组。中和剂实验分组及方法。见表1。
分别在6组中获取10μL溶液,并将所获取溶液接种至营养琼脂培养基,于37℃厌氧培养箱(80%N2+10%H2+10CO2)中持续培养72h,统计细菌数量,根据观察、统计情况分析中和剂作用。满足下述条件认为中和剂适合应用于实验当中:(1)a组细菌不生长,或细菌数量<b组;(2)b组细菌数量<100cfu/mL;(3)c、d、e三组细菌数量相差<10%;(4)f组细菌不生长。
使用臭氧水生成器制备2mg/L的臭氧水溶液,按照不稀释、1倍稀释、2倍稀释顺序获得2mg/L、1mg/L、0.5mg/L 臭氧水,留待使用。取两支试管,分别标记实验组1、实验组2。实验组1:获取4mL臭氧水,加入0.5mL菌液,充分混匀,反应至规定观察时间后,获取0.5mL臭氧水和菌液的混合液,加入4.5mL中和剂,充分混合,获取0.5mL混合液,进行琼脂倾注培养(2份),在48℃厌氧培养箱中持续培养48h,观察并统计细菌数量(cfu)。实验组2:将臭氧水换为等量蒸馏水,其他操作均与实验组1相同。每种浓度臭氧水及实验组2均重复实验3次,取平均数。根据实验组1、实验组2细菌数量(cfu)计算杀菌率。
杀菌率=(实验组2细菌数量-实验组1细菌数量)实验组2细菌数量
观察以下指标:(1)分析不同温度条件下,臭氧水浓度变化情况;(2)分析中和剂实验结果;(3)分析不同浓度臭氧水对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的杀菌作用。