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臭氧水对慢性骨髓炎常见病原菌灭菌作用的实验研究

塔依尔江·亚生¹，艾尼·米吉提²，艾合买提江·玉素甫³

（1新疆医科大学第六附属医院创伤骨科，乌鲁木齐 830001；2新疆喀什地区第二人民医院骨科，新疆喀什 844000；3新疆医科大学第一附属医院骨科中心显微修复外科乌鲁木齐 830054）

摘要

目的观察臭氧水的稳定性及对慢性骨髓炎最常见三种病原菌的体外灭菌效果，为臭氧水治疗慢性骨髓炎提供初步的理论依据。

方法 1、制备臭氧水，分别置于不同温度的恒温实验箱，观察不同时间臭氧水浓度变化情况。2、将2mg/L的臭氧水溶液稀释，获得不同浓度的臭氧水。取两组。实验组1：获取4mL臭氧水，加入0.5mL菌液，再加入4.5mL中和剂，获取混合液进行培养，观察并统计细菌数量。实验组2：将臭氧水换为等量蒸馏水，其他操作均与实验组1相同。每种浓度臭氧水及实验组2均重复实验3 次，取平均数。根据实验组1、2细菌数量计算杀菌率。

结果臭氧水稳定性与温度相关，随着温度升高，臭氧水浓度衰竭速度加快、半衰期缩短。应用浓度1.0mg/L的臭氧水2min，或应用浓度2.0mg/L的臭氧水1min，可以完全杀灭金黄色葡萄球菌；应用浓度1.0mg/L的臭氧水2min，或2.0mg/L臭氧水30s，可以完全杀灭铜绿假单胞菌；应用浓度1.0mg/L或2.0mg/L臭氧水30s，可以完全杀灭大肠埃希菌。

结论臭氧水具有不稳定性，其浓度会受温度、时间影响；臭氧水对于三种慢性骨髓炎主要病原菌都具有杀灭作用。

关键词 臭氧水、慢性骨髓炎、病原菌、杀菌率

臭氧，最早由Schorbein(德国人)在1840年发现并予以命名。臭氧，是天然的广谱、高效杀菌剂，能够快速杀灭多种细菌、病毒、微生物，其主要机制为：臭氧作为一种氧化性物质，能够在非常短的时间内对细菌、病毒、微生物的内部生物结构造成破坏，使其凋亡^[1]。与其他具有氧化性杀菌作用的物质相比，臭氧的杀菌性能更强、作用时间更短，而且杀菌后剩余臭氧可以在短时间内分解为氧气，进入机体循环当中，不会对人体造成危害^[2]。臭氧可以溶解在水中，其溶解度约是氧气的10倍，将臭氧溶于水，配置成臭氧水也同样能够发挥臭氧的杀菌作用，更便于临床应用和控制^[3]。臭氧水抗菌治疗为学界关注的热点问题。分析慢性骨髓炎病原学相关研究资料，可以发现，慢性骨髓炎病原菌种类多样，以革兰阳性菌和革兰阴性菌为主，其中常见的三种病原菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌^[4-6]。因此，理想的慢性骨髓炎治疗方法必须对上述主要病原菌有较强的杀灭作用。本实验以三种慢性骨髓炎常见致病菌株为例，开展臭氧水杀菌实验，初步判断臭氧水对于骨髓炎常见病原菌的杀灭作用，以为进一步研究的开展奠定基础。

资料与方法

1.1

实验材料

1.1.1菌株来源

金黄色葡萄球菌SAATCC6538；铜绿假单胞菌ATCC15442；大肠杆菌ATCC8099。上述菌株均来源于中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.2臭氧水制备

使用臭氧，生成臭氧，然后将臭氧与纯净水混合，形成臭氧水。实验期间，以碘量法检测臭氧水浓度，并将配置臭氧水前使用的自来水设置为空白实验组2，进行对照分析，以避免自来水中原有氧气干扰检测结果。

1.2

方法

1.2.1 菌液制备

复苏金黄色葡萄球菌SAATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌ATCC8099，并分别接种于营养琼脂培养基中，持续培养18～24h。于菌株培养后，使用无菌接种环挑取培养物，置于0.85%无菌生理盐水中，制成细菌换悬液，并以麦氏比浊法适当调节细菌含量(5×10⁵～5×10⁶cfu)。

1.2.2 臭氧水稳定性检测

使用臭氧水生成器制备臭氧水后，取容量为1L的大烧杯，于充分清洗、消毒后，以臭氧水冲洗3次，每次3min，然后用于连续接取4份臭氧水，分别置于4℃、10℃、23℃、30℃恒温实验箱中，观察不同时间臭氧水浓度(mg/L)变化情况，分析臭氧水在不同温度条件中的稳定性。

碘量法检测原理：臭氧能够和碘化钾水溶液发生反应，并游离出碘。于臭氧水配置后获取样本，使用0.01mol/L硫代硫酸钠溶液(硫代硫酸钠标准溶液)滴定游离碘，计算硫代硫酸钠消耗量即可得出臭氧量。具体反应公式如下：

O₃+2KI→O₂+I₂+2KOH

I₂+2Na₂S₂O₃→2Nal+Na₂S₄O₃

碘量法具体检测步骤：获取100mL臭氧水，将其转移到500mL容量瓶当中，并加入20mL碘化钾溶液、10mL硫酸溶液，以缓慢晃动方式使液体完全混匀，然后加入硫代硫酸钠标准溶液，持续滴定至颜色消失，一边滴定一边轻柔晃动。于滴定结束后，统计硫代硫酸钠标准溶液使用量。臭氧量(C)计算公式如下：

C=2.4×L(其中L为硫代硫酸钠标准溶液使用量，单位mL)

1.2.3 中和剂实验

使用臭氧水生成器制备2mg/L的臭氧水溶液，以金黄色葡萄球菌为例，进行中和剂实验，以选择理想中和剂。以《医院消毒技术规范》中的相关规定为依据，将实验设置为6组。中和剂实验分组及方法。见表1。

分别在6组中获取10μL溶液，并将所获取溶液接种至营养琼脂培养基，于37℃厌氧培养箱(80%N₂+10%H₂+10CO₂)中持续培养72h，统计细菌数量，根据观察、统计情况分析中和剂作用。满足下述条件认为中和剂适合应用于实验当中：(1)a组细菌不生长，或细菌数量＜b组；(2)b组细菌数量＜100cfu/mL；(3)c、d、e三组细菌数量相差＜10%；(4)f组细菌不生长。

1.2.4 杀菌实验

使用臭氧水生成器制备2mg/L的臭氧水溶液，按照不稀释、1倍稀释、2倍稀释顺序获得2mg/L、1mg/L、0.5mg/L 臭氧水，留待使用。取两支试管，分别标记实验组1、实验组2。实验组1：获取4mL臭氧水，加入0.5mL菌液，充分混匀，反应至规定观察时间后，获取0.5mL臭氧水和菌液的混合液，加入4.5mL中和剂，充分混合，获取0.5mL混合液，进行琼脂倾注培养(2份)，在48℃厌氧培养箱中持续培养48h，观察并统计细菌数量(cfu)。实验组2：将臭氧水换为等量蒸馏水，其他操作均与实验组1相同。每种浓度臭氧水及实验组2均重复实验3次，取平均数。根据实验组1、实验组2细菌数量(cfu)计算杀菌率。

杀菌率=(实验组2细菌数量-实验组1细菌数量)实验组2细菌数量

1.3

观察指标

观察以下指标：(1)分析不同温度条件下，臭氧水浓度变化情况；(2)分析中和剂实验结果；(3)分析不同浓度臭氧水对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的杀菌作用。

1.4

统计学分析

应用SPSS 26.0系统分析，计数资料以(n，%)形式表示，χ2检验；计量资料以(均数±标准差)形式表示，t检验；检验水准P＜0.05。

结果

2.1

臭氧水稳定性分析

臭氧水稳定性与温度有关，随着温度升高，臭氧水浓度衰竭速度加快、半衰期缩短。

2.2

中和剂实验结果分析

重复3次中和剂实验结果显示，0.5%硫代硫酸钠(Na₂S₂O₂)的磷酸盐缓冲液能够有效中和臭氧水，中和剂对细菌生长未产生明显影响，也未发现中和产物对细菌生长产生明显影响。见表4。

2.3

不同浓度臭氧水杀菌效果分析

2.3.1 臭氧水对金黄色葡萄球菌的杀灭作用

对于金黄色葡萄球菌，应用浓度0.5mg/L的臭氧水，作用30s～3min的平均杀菌率在91.27%～95.26%之间，均未达到100%；应用浓度1.0mg/L的臭氧水，作用2min时杀菌率达到100%；应用浓度2.0mg/L的臭氧水，作用1min时杀菌率达到100%。见表5、图3。

2.3.2 臭氧水对铜绿假单胞菌的杀灭作用

对于铜绿假单胞菌，应用浓度0.5mg/L的臭氧水，作用30s～3min的平均杀菌率在90.24%～94.89%之间，均未达到100%；应用浓度1.0mg/L的臭氧水，作用2min时杀菌率达到100%；应用浓度2.0mg/L的臭氧水，作用30s时杀菌率达到100%。见表6、图4。

2.3.3 臭氧水对大肠杆菌的杀灭作用

对于大肠杆菌，应用浓度0.5mg/L的臭氧水，作用30s～3min的平均杀菌率在90.37%～95.12%之间；应用浓度1.0mg/L的臭氧水，作用30s时杀菌率达到100%；应用浓度2.0mg/L的臭氧水，作用30s时杀菌率达到100%。

讨论

细菌感染，是目前全世界面临的重要公共卫生问题，随着各种抗生素的不断增多及抗生素滥用问题演化，细菌感染控制难度进一步提升，严重损害人类生命健康^[7]。臭氧(O₃)为强氧化剂，在目前发现的物质中，臭氧的氧化性仅次于氟，是一种广谱、高效、快速杀菌剂。医用臭氧的发明及应用为细菌感染的预防及治疗提供了新思路。臭氧的分子结构极其不稳定，能够分解为稳态氧离子(O2)、单一新生态氧原子(O)、羟基(OH)，其中O、OH均具有极强氧化能力，为理想的溶菌物质，能够在短时间内进入细菌、病毒、微生物当中，破坏其内部结构，杀灭致病菌^[8]。

臭氧在水中具有高溶解率，臭氧进入水中后，部分臭氧分子(O₃)进入水中，还有许多臭氧分子能够在分解后和水分子(H₂O)结合，合成具有更强氧化性的羟基(OH-)，羟基被视为可以在水中作用、最活跃的氧化剂，能够氧化多种大分子生物(脂肪酸、蛋白质、多糖、氨基酸、核酸等)，不只是单独破坏某一种细菌结构，因此具有广谱抗菌、杀菌作用，而且不会发生耐药^[9]。本次开展臭氧水杀菌实验，以慢性骨髓炎常见病原菌菌株(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌)为例，分析臭氧水对于上述病原菌的杀灭效果。以下结合本次研究数据，对臭氧水的稳定性特点、杀灭骨髓炎病原菌效果进行讨论分析，为后续实验开展奠定基础。

3.1

臭氧水的稳定性分析

本次研究显示，臭氧水中臭氧浓度与温度及时间有关。随着温度条件的升高，臭氧水稳定性变差，浓度衰减速度加快。4℃时平均半衰期为131.05min，10℃时平均半衰期为129.73min，23℃时平均半衰期为20.81min，30℃时平均半衰期为6.21min。这与徐贞杰等^[10]的结论较为一致。臭氧水浓度随温度、时间变化而变化的特点与臭氧水的稳定性差有关。

臭氧为不稳定物质，容易分解成为氧气，其杀菌作用也会受到影响。随着温度升高、时间延长，臭氧水的稳定性变差，杀菌性能降低。因此，临床中应使用新鲜配置臭氧水，并避免高温放置，以免随着时间延长、温度升高，臭氧水浓度降低，影响作用效果。23℃为一般室温条件，其半衰期为20.81min，提示室温条件下配置的臭氧水应尽量在20min内使用，否则其作用效果将大大减弱。

3.2

臭氧水对于主要慢性骨髓炎病原菌的杀灭效果分析

本次研究结果显示，臭氧水对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的杀灭效果各不相同。随着臭氧水浓度升高，对于上述三种病原菌的杀灭作用增强。1.0mg/L臭氧水作用30s能够100%杀灭大肠杆菌；2.0mg/L臭氧水作用30s能够100%杀灭铜绿假单胞菌；而0.5、1.0、2.0mg/L臭氧水都不能在作用30s内完全杀灭金黄色葡萄球菌，使用2.0mg/L臭氧水需要作用1min能够100%杀灭葡萄球菌。这与不同病原菌细胞膜厚度、细胞结构、细胞成分差异有关。

臭氧水对于各种病原菌的杀伤性既与其自身稳定性、浓度水平有关，又与病原菌种类有关。慢性骨髓炎病原菌种类多样，革兰阳性菌中以金黄色葡萄球菌为主要代表，革兰阴性菌中以铜绿假单胞菌、大肠杆菌为主。本次研究中臭氧水对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌均具有杀伤作用。其中对于两种革兰阴性菌的杀灭作用稍强，对铜绿假单胞菌应用2.0mg/L臭氧水作用30s杀菌率达到100%；对大肠杆菌应用1.0mg/L臭氧水作用30s杀菌率达到100%。对于金黄色葡萄球菌的杀灭作用相对较弱，灭菌效果最好、最快的方案为使用2.0mg/L臭氧水作用1min。对于不同浓度臭氧水的杀菌效果问题，不同研究者得出的结论各不相同。如索标等^[11]研究指出，2.0mg/L、8.0mg/L 臭氧水对金黄色葡萄球菌作用1min，杀菌率均达到100%。鲁建云等^[12]研究显示，0.3mg/L臭氧水对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作用1min，杀菌率均达到100%。叶菊花等^[13]指出，1.0mg/L臭氧水作用铜绿假单胞菌1min，就能完全杀灭病原菌；Marcia DOSS^[14]研究中，1.0mg/L臭氧水作用大肠杆菌30s，杀菌率100%。综合分析大量研究资料，可以发现，在同样条件状态下，臭氧水对于革兰阴性菌的杀灭作用优于革兰阳性菌。这可能与两类病原菌结构特点有关。革兰阴性菌厚度相对较低，肽聚糖含量少，且为单层肽聚糖结构，网络较疏松，不含有多糖，而且革兰氏阴性细菌不能形成芽孢，臭氧对于该类细菌的穿透力更强，杀菌作用更好。而革兰阳性菌中很多细菌能够形成芽孢，细胞中非细胞壁结构较厚，存在多层肽聚糖，网络较为紧密、坚固，臭氧的穿透力会受到一定影响。本次研究结果符合一般研究规律。不同研究者的研究结果存在差异与多种因素有关，如：研究地点、时间、当地抗生素应用情况、研究中应用的实验方法及实验条件等。本次研究在规范研究基础上，探究臭氧水对于三种主要慢性骨髓炎病原菌的杀灭作用，能够为进一步实验研究的开展准备条件，以便开展臭氧水灌注负压吸引治疗大鼠股骨慢性骨髓炎实验时，指导临床合理配置臭氧水、科学选择制备大鼠股骨慢性骨髓炎模型所需病原菌。

小结

基于臭氧水杀菌实验，本研究认为臭氧水具有不稳定性，其浓度会受实验温度、时间影响，因此在应用臭氧水开展实验、进行治疗时，应注意应用新鲜配置臭氧水，并尽量降低臭氧水应用温度，在室温条件下，应尽量在臭氧水配置20min内应用。另外，本实验证实臭氧水对于三种慢性骨髓炎主要病原菌都具有杀灭作用，2.0mg/L臭氧水作用1min对于三种主要骨髓炎病原菌的杀灭作用均能达到100%。